Несмотря на программы вакцинирования животных, инфекционные заболевания наносят серьезный экономический ущерб. Особую опасность представляют колибактериозы и сальмонеллезы у кур в условиях птицефабрик, когда птица содержится в скученном состоянии, что облегчает передачу возбудителя между особями [1]. Контроль над этими инфекциями требует комплексного подхода, включающего вакцинирование, оптимизацию кормления и содержания, профилактические мероприятия. Разработанный ранее метод генотипирования патогенных штаммов микроорганизмов, наносящих большой экономический ущерб животноводству, был использован на двух видах бактерий – кишечная палочка и сальмонелла. Генотипирование методом двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ) позволяет получить своеобразный штрих-код для каждого бактериального штамма. Сопоставление генотипов патогена, выделенных из разных особей, позволяет говорить о перезаражении, если генотипы идентичны. С другой стороны, если генотипы не совпадают, то особи заразились из разных источников. Генотипирование в настоящее время становится важным элементом в системе профилактических мероприятий, направленных на недопущение распространения патогенов [2; 3].
Метод генотипирования ДРИМ основан на одновременном использовании двух эндонуклеаз рестрикции для расщепления геномной ДНК бактерии и мечении фрагментов ДНК с помощью ДНК-полимеразы [4]. Первая эндонуклеаза расщепляет ДНК с образованием 3′-усеченных концов, которые могут включить метку биотинилированный дезоксицитозинтрифосфат (Bio-dCTP) в реакции достройки. При подборе этого фермента уделяют внимание количеству сайтов расщепления, которое должно быть в пределах 15-30. Это позволяет получить ограниченное число меченых биотином фрагментов ДНК. Наряду с первым ферментом, в реакции ДРИМ присутствует вторая эндонуклеаза рестрикции, необходимая при укорочении фрагментов ДНК для их использования при разделении по длине в обычном агарозном геле. Особенностью второго фермента является способность продуцировать фрагменты ДНК с тупыми либо 3′-выступающими концами, которые не могут включать биотиновую метку [5; 6].
Предварительный поиск in silico в базе данных секвенированных геномов патогенных микроорганизмов позволил подобрать комбинацию ферментов, подходящих одновременно для разных видов микроорганизмов – Escherichia coli и Salmonella enterica. Для генотипирования были предложены в качестве первого фермента XbaI и в качестве второго – PstI. Данные ферменты позволили получить 20-40 фрагментов ДНК, распределение которых на фильтре было оптимальным с точки зрения достижения высокой дискриминации бактериальных штаммов и легкости учета фрагментов ДНК.
Бактериальные культуры выращивались из материала, полученного от больных и павших кур по стандартными микробиологичесим методикам. Для выделения геномной ДНК было достаточно 1 мл жидкой культуры. ДНК выделяли по общепринятым методам с использованием фенольно-хлороформенной экстракции.
По результатам генотипирования изоляты №1 и №2 (Salmonella typhimurium) были идентичными. Бактерии выращивались из одной особи (сердце и двенадцатиперстная кишка, соответственно). Изоляты №3 и №4 (Salmonella enteritidis), выделенные из сердца и печени одной яичной курицы также были идентичными, но существенно отличались от изолятов №1/№2.
У E.coli была выявлена группа (кластер) идентичных изолятов: №10, 11, 12, и 13. Изоляты №10 и №11 выделялись из сердца и желчного пузыря одной курицы второго птичника, а изолят №12 – из сердца другой особи, содержавшейся на первом птичнике. Изолят №13 соответствовал микроорганизму, выделенному из печени еще одной особи в пределах второго птичника. Учитывая большое генетическое разнообразие штаммов кишечной палочки, случайное совпадение генетических профилей маловероятно. Скорее всего, можно говорить о передаче одного и того же штамма возбудителя между двумя птичниками (на примере изолятов второго птичника №10, №11, №13 и первого птичника №12) и между особями в пределах одного птичника (изоляты №10/№11 и №13).
Помимо одного кластера с идентичными изолятами E.coli, все остальные 9 изолятов являлись генетически уникальными штаммами, значительно отличающимися друг от друга и от указанного выше кластера.
В пределах одного птичника у разных особей выделяются совершенно разные генотипы E.coli (например, изоляты №14 и №15), что говорит о циркулировании одновременно разных штаммов на птичнике. Такая же картина наблюдалась на другой птицефабрике (изоляты №16 и №17).
В целом, выявлено значительное генетическое разнообразие бактериальных штаммов, зарегистрирован только один случай вероятного перезаражения птиц как внутри птичника, так и между двух птичников, что проявилось в виде 4-х идентичных изолятов. Полученные данные о распространении патогенов нужно учитывать при планировании ветеринарно-санитарных мероприятий на птицефабриках с целью разрыва эпизоотической цепи и снижения вероятности передачи возбудителя между курами.
Библиографический список
- Добрина М. Н. Нужен постоянный контроль сальмонеллеза // Животноводство России. 2011. № 3. С. 11–13.
- Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Фенотипическое и молекулярно-генетическое типирование сальмонелл: реалии и перспективы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. № 6. С. 88–93.
- Жебрун А.Б., Мукомолов С.Л., Нарвская О.В. Генотипирование и молекулярное маркирование бактерий и вирусов в эпидемиологическом надзоре за актуальными инфекциями // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 4. С. 28–36.
- Terletski V., Schwarz S., Carnwath J., and Niemann H. Typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Choleraesuis, Typhimurium, Dublin and laboratory strains of Escherichia coli using subtracted restriction fingerprinting (SRF) // Microbiol. Res. 2003. V. 158. P. 135–142.
- Terletskiy V., Kuhn G., Francioli P., Blanc D. Application and evaluation of double digest selective label (DDSL) typing technique for Pseudomonas aeruginosa hospital isolates // J. Microbiol. Methods. 2008. V. 72. No. 3. P. 283–287.
- Terletskiy V., Tyshchenko V., Martinez-Ballesteros I. et al. Validation of Double Digest Selective Label database for sequenced prokaryotic genomes // Bioinformatics. 2010. V. 26. No. 3. P. 417–418.