УДК 579.62: 579.253.4

ВОЗМОЖНОСТЬ ОДНОВРЕМЕННОГО ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ САЛЬМОНЕЛЛ И КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ С ЦЕЛЬЮ ВЫЯВЛЕНИЯ ПУТЕЙ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ПАТОГЕНА В УСЛОВИЯХ ПТИЦЕФАБРИК

Терлецкий Валерий Павлович1, Тыщенко Валентина Ивановна2, Новикова Оксана Борисовна3
1Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики
2Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики
3Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник отдела микробиологии

Аннотация
Использованный ранее метод генотипирования бактериальных изолятов был применен на изолятах кишечной палочки и сальмонелл. Поиск оптимальных эндонуклеаз рестрикции позволил подобрать пару ферментов, подходящих одновременно для этих видов патогенов. Полученные данные помогут планировать ветеринарно-санитарные мероприятия, направленные на профилактику инфекционных заболеваний у кур.

Ключевые слова: генотипирование, кишечная палочка, профилактика инфекционных заболеваний, сальмонелла, эндонуклеазы рестрикции


POTENTIAL FOR SIMULTANEOUS GENOTYPING OF ESCHERICHIA COLI AND SALMONELLA FIELD ISOLATES AIMED AT ELUCIDATION OF ROUTES OF PATHOGEN TRANSMISSION AT POULTRY FARM SETTING

Terletskiy Valery Pavlovich1, Tyshchenko Valentina Ivanovna2, Novikova Oksana Borisovna3
1Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding, D.Sc., Professor, senior researcher of the Laboratory of Molecular Cytogenetics
2Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding, Cand.Sc. in biology, senior researcher of the Laboratory of Molecular Cytogenetics
3All Russia Research Veterinary Institute of Poultry Sciences, Cand.Sc. in veterinary medicine, senior researcher of the Department of Microbiology

Abstract
The genotyping technique which was used earlier for discrimination of bacterial isolates, was applied for Escherichia coli and Salmonella enterica. Search for optimal restriction endonucleases allowed for selecting pair of enzymes suitable simultaneously for these pathogen species. Data obtained will help plan veterinary measures aimed at prevention of infectious diseases in chicken.

Keywords: Escherichia coli, genotyping, prevention of infectious diseases, restriction endonucleases


Рубрика: Сельское хозяйство

Библиографическая ссылка на статью:
Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О.Б. Возможность одновременного генотипирования полевых изолятов сальмонелл и кишечной палочки с целью выявления путей распространения патогена в условиях птицефабрик // Сельское, лесное и водное хозяйство. 2015. № 6 [Электронный ресурс]. URL: http://agro.snauka.ru/2015/06/2422 (дата обращения: 04.05.2017).

Несмотря на программы вакцинирования животных, инфекционные заболевания наносят серьезный экономический ущерб. Особую опасность представляют колибактериозы и сальмонеллезы у кур в условиях птицефабрик, когда птица содержится в скученном состоянии, что облегчает передачу возбудителя между особями [1]. Контроль над этими инфекциями требует комплексного подхода, включающего вакцинирование, оптимизацию кормления и содержания, профилактические мероприятия. Разработанный ранее метод генотипирования патогенных штаммов микроорганизмов, наносящих большой экономический ущерб животноводству, был использован на двух видах бактерий – кишечная палочка и сальмонелла. Генотипирование методом двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ) позволяет получить своеобразный штрих-код для каждого бактериального штамма. Сопоставление генотипов патогена, выделенных из разных особей, позволяет говорить о перезаражении, если генотипы идентичны. С другой стороны, если генотипы не совпадают, то особи заразились из разных источников. Генотипирование в настоящее время становится важным элементом в системе профилактических мероприятий, направленных на недопущение распространения патогенов [2; 3].

Метод генотипирования ДРИМ основан на одновременном использовании двух эндонуклеаз рестрикции для расщепления геномной ДНК бактерии и мечении фрагментов ДНК с помощью ДНК-полимеразы [4]. Первая эндонуклеаза расщепляет ДНК с образованием 3′-усеченных концов, которые могут включить метку биотинилированный дезоксицитозинтрифосфат (Bio-dCTP) в реакции достройки. При подборе этого фермента уделяют внимание количеству сайтов расщепления, которое должно быть в пределах 15-30. Это позволяет получить ограниченное число меченых биотином фрагментов ДНК. Наряду с первым ферментом, в реакции ДРИМ присутствует вторая эндонуклеаза рестрикции, необходимая при укорочении фрагментов ДНК для их использования при разделении по длине в обычном агарозном геле. Особенностью второго фермента является способность продуцировать фрагменты ДНК с тупыми либо 3′-выступающими концами, которые не могут включать биотиновую метку [5; 6].

Предварительный поиск in silico в базе данных секвенированных геномов патогенных микроорганизмов позволил подобрать комбинацию ферментов, подходящих одновременно для разных видов микроорганизмов – Escherichia coli и Salmonella enterica. Для генотипирования были предложены  в качестве первого фермента XbaI и в качестве второго –  PstI. Данные ферменты позволили получить 20-40 фрагментов ДНК, распределение которых на фильтре было оптимальным с точки зрения достижения высокой дискриминации бактериальных штаммов и легкости учета фрагментов ДНК.

Бактериальные культуры выращивались из материала, полученного от больных и павших кур по стандартными микробиологичесим методикам. Для выделения геномной ДНК было достаточно 1 мл жидкой культуры. ДНК выделяли по общепринятым методам с использованием фенольно-хлороформенной экстракции.

По результатам генотипирования изоляты №1 и №2 (Salmonella typhimurium) были идентичными. Бактерии выращивались из одной особи (сердце и двенадцатиперстная кишка, соответственно). Изоляты №3 и №4 (Salmonella enteritidis), выделенные из сердца и печени одной яичной курицы также были идентичными, но существенно отличались от изолятов №1/№2.

У E.coli была выявлена группа (кластер) идентичных изолятов: №10, 11, 12, и 13. Изоляты №10 и №11 выделялись из сердца и желчного пузыря одной курицы второго птичника, а изолят №12 – из сердца другой особи, содержавшейся на первом птичнике. Изолят №13 соответствовал микроорганизму, выделенному из печени еще одной особи в пределах второго птичника. Учитывая большое генетическое разнообразие штаммов кишечной палочки, случайное совпадение генетических профилей маловероятно. Скорее всего, можно говорить о передаче одного и того же штамма возбудителя между двумя птичниками (на примере изолятов второго птичника №10, №11, №13 и первого птичника №12) и между особями в пределах одного птичника (изоляты №10/№11 и №13).

Помимо одного кластера с идентичными изолятами E.coli, все остальные 9 изолятов являлись генетически уникальными штаммами, значительно отличающимися друг от друга и от указанного выше кластера.

В пределах одного птичника у разных особей выделяются совершенно разные генотипы E.coli (например, изоляты №14 и №15), что говорит о циркулировании одновременно разных штаммов на птичнике. Такая же картина наблюдалась на другой птицефабрике (изоляты №16 и №17).

В целом, выявлено значительное генетическое разнообразие бактериальных штаммов, зарегистрирован только один случай вероятного перезаражения птиц как внутри птичника, так и между двух птичников, что проявилось в виде 4-х идентичных изолятов. Полученные данные о распространении патогенов нужно учитывать при планировании ветеринарно-санитарных мероприятий на птицефабриках с целью разрыва эпизоотической цепи и снижения вероятности передачи возбудителя между курами.


Библиографический список
  1. Добрина М. Н. Нужен постоянный контроль сальмонеллеза // Животноводство России. 2011. № 3. С. 11–13.
  2. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Фенотипическое и молекулярно-генетическое типирование сальмонелл: реалии и перспективы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. № 6. С. 88–93.
  3. Жебрун А.Б., Мукомолов С.Л., Нарвская О.В. Генотипирование и молекулярное маркирование бактерий и вирусов в эпидемиологическом надзоре за актуальными инфекциями // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 4. С. 28–36.
  4. Terletski V., Schwarz S., Carnwath J., and Niemann H. Typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Choleraesuis, Typhimurium, Dublin and laboratory strains of Escherichia coli using subtracted restriction fingerprinting (SRF) // Microbiol. Res. 2003. V. 158. P. 135–142.
  5. Terletskiy V., Kuhn G., Francioli P., Blanc D. Application and evaluation of double digest selective label (DDSL) typing technique for Pseudomonas aeruginosa hospital isolates // J. Microbiol. Methods. 2008. V. 72. No. 3. P. 283–287.
  6. Terletskiy V., Tyshchenko V., Martinez-Ballesteros I. et al. Validation of Double Digest Selective Label database for sequenced prokaryotic genomes //  Bioinformatics. 2010. V. 26. No. 3. P. 417–418.


Все статьи автора «Терлецкий Валерий Павлович»


© Если вы обнаружили нарушение авторских или смежных прав, пожалуйста, незамедлительно сообщите нам об этом по электронной почте или через форму обратной связи.

Связь с автором (комментарии/рецензии к статье)

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться, чтобы оставить комментарий.

Если Вы еще не зарегистрированы на сайте, то Вам необходимо зарегистрироваться: